基于TurboID的邻近标记质谱（PL-MS）实验指南：从质粒构建到质谱鉴定
引言
此前我们学习了TurboID融合表达系统的构建，接下来我们继续学习。本系列我们以CRISPR/Cas9基因编辑技术、TurboID邻近标记方案为例，为研究生提供一套详细、可操作的实验流程。方案将涵盖从POI-TurboID融合表达系统的设计与构建，到稳转细胞系的建立与验证，再到邻近生物素化标记、细胞裂解、链霉亲和素富集以及样品制备用于质谱分析的全过程。通过遵循本方案，研究者有望高效、准确地鉴定其POI在生理条件下的互作蛋白，为深入理解其生物学功能和相关疾病机制提供关键线索。本方案基于编者文献查询及经验总结，不同课题的POI、细胞等条件不一，本文仅提供实验通用条件起步参考，实际课题应根据实验反馈做方法学优化调整。
稳转细胞系的建立与验证
获得表达POI-TurboID融合蛋白的质粒或CRISPR系统后，下一步是将其导入靶细胞并筛选出能够稳定表达融合蛋白的细胞系。这一过程对于后续邻近标记实验的可靠性和可重复性至关重要。
细胞培养与准备
❶细胞系选择:根据研究的具体目标选择合适的哺乳动物细胞系。例如，HEK293T细胞因其易于转染和高表达特性常被用于初步研究；HeLa细胞则常用于细胞生物学和显微成像研究。确保所选细胞系适合您的研究问题。
❷培养条件:
严格遵循细胞系供应商推荐的培养基类型、血清浓度 (通常为10% FBS)、培养温度 (通常为37°C) 和CO2浓度 (通常为5%)。定期传代，避免细胞过度生长或老化。 (Creative BioMart, Protocol of Stable Cell Line Generation; Lonza, Guideline for Generation of Stable Cell Lines)。
❸转染前状态:
确保细胞处于对数生长期，健康无污染 (特别是支原体污染)。转染前一天传代，使细胞在转染时达到适宜的汇合度 (通常为70-90%，具体根据所选转染方法的要求调整)。
将表达系统导入细胞 (转染/转导)
CRISPR/Cas9系统导入
●质粒共转染：将sgRNA表达质粒、Cas9表达质粒 (如果不是RNP形式或整合型Cas9表达载体) 和HDR Donor质粒按照预先优化的比例混合后，通过选定的转染方法导入细胞。
●RNP转染：将体外组装好的Cas9 RNP与HDR Donor质粒一同或先后导入细胞。
质粒过表达系统导入
将构建好的POI-TurboID表达质粒通过选定的转染方法导入细胞。
常用转染/转导方法
❶脂质体介导转染:如Lipofectamine™ 2000/3000 (Thermo Fisher Scientific)、FuGENE® (Promega) 等。操作相对简便，适用于多种贴壁和部分悬浮细胞系。需根据细胞类型和质粒大小优化脂质体与DNA的比例及用量。
❷电穿孔 (Electroporation/Nucleofection™):通过高压电脉冲在细胞膜上形成暂时性孔道，使DNA导入。对于难转染的细胞系 (如原代细胞、干细胞、免疫细胞、悬浮细胞) 或需要高转染效率时，电穿孔 (特别是Lonza的Nucleofection™技术) 是非常有效的方法 (Lonza Guideline)。
❸病毒介导转导:如慢病毒 (Lentivirus) 或腺相关病毒 (AAV)。病毒载体能高效感染多种类型的分裂和非分裂细胞，并将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中 (慢病毒) 或以附加体形式长期存在 (AAV，取决于血清型和细胞类型)。适用于构建稳转细胞系或进行在体研究。但操作相对复杂，需要P2级生物安全实验室，且需注意病毒的制备、滴度测定和潜在的插入突变风险。
阳性细胞筛选与单克隆获取
药物筛选
转染/转导后24-48小时 (具体时间取决于质粒上抗性基因的表达启动时间和细胞状态)，更换含有相应筛选药物的新鲜培养基。常用筛选药物及其对应抗性基因包括：
G418 (Geneticin®): NeoR (Neomycin phosphotransferase)
Puromycin: PuroR (Puromycin N-acetyltransferase)
Hygromycin B: HygroR (Hygromycin B phosphotransferase)
筛选药物的有效浓度需要通过预实验 (kill curve) 确定，即找到在7-14天内能杀死所有未转染亲本细胞的最低药物浓度。
筛选周期
持续用含筛选药物的培养基培养细胞，直至未转染的对照细胞全部死亡，阳性细胞克隆开始形成可见的集落 (通常需要1-3周)。期间注意观察细胞状态，定期更换含药培养基。
单克隆细胞株的获取
为了确保后续实验的均一性和可重复性，必须从筛选存活的混合细胞群体中分离并扩增单克隆细胞株。
●有限稀释法 (Limiting Dilution): 将筛选后存活的细胞进行系列稀释，然后接种到96孔板中，使得每个孔中平均接种的细胞数远小于1个 (如0.3-0.5个细胞/孔)。理论上，这样生长起来的细胞集落来源于单个细胞。
●克隆环法 (Cloning Rings) / 细胞刮取法: 在培养皿中，用显微镜观察并挑选形态良好、独立生长的细胞克隆。用浸过胰酶的无菌克隆环套住克隆，或用移液器枪头轻轻刮取克隆边缘，然后将克隆细胞转移至新的培养孔中进行扩增。
●流式细胞分选 (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS): 如果POI-TurboID融合蛋白带有荧光标签 (如GFP, RFP)，或者HDR Donor质粒中包含与POI-TurboID共表达的荧光报告基因，可以利用FACS直接分选表达阳性的单细胞到96孔板中进行培养。这是获取单克隆最高效的方法之一。
稳转细胞系验证
获得的单克隆细胞株必须经过严格验证，以确保POI-TurboID融合蛋白的正确表达和定位，以及功能的完整性（如果可能）。
基因组层面验证 (主要针对CRISPR/Cas9介导的内源性标记)
●方法:提取单克隆细胞的基因组DNA。设计引物分别扩增包含目标编辑区域5'端和3'端连接点的DNA片段。
●分析: 通过Sanger测序或下一代测序 (NGS) 验证TurboID序列是否按照预期精确插入到POI基因座，检查连接处有无框移突变、非预期重组或等位基因状态 (纯合/杂合)。
蛋白表达水平验证 (Western Blot)
●抗体:使用特异性识别POI的抗体、识别TurboID的抗体 (如果有商业化的) 或识别融合蛋白上亲和标签 (如anti-FLAG, anti-HA, anti-V5) 的抗体。
●检测: 收集细胞裂解液，进行SDS-PAGE和Western Blot分析。确认POI-TurboID融合蛋白的表达，并检查其分子量是否符合预期 (POI分子量 + TurboID分子量 (约35kDa) + 标签分子量)。比较不同单克隆之间的表达差异，选择表达水平适中 (避免过高或过低，特别是对于内源性标记，应接近内源POI水平) 且稳定的克隆进行后续实验。 (May et al., Cells 2020 提供了BioID/TurboID表达的WB验证示例)。
亚细胞定位验证 (Immunofluorescence / Confocal Microscopy):
●目的: 确认POI-TurboID融合蛋白是否正确定位到POI预期的亚细胞区域 (如细胞核、线粒体、内质网、细胞膜等)。错误的定位可能导致非生理相关的邻近标记。
●方法: 进行免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜观察融合蛋白的定位。可以与已知的细胞器标志物 (如DAPI染细胞核，MitoTracker染线粒体，Calreticulin染内质网等) 进行共染，以更精确地确认其亚细胞位置。
●评估: 确保TurboID的融合没有显著改变POI的正常亚细胞定位。如果POI本身定位未知，此步骤也可帮助确定其定位。 (May et al., Cells 2020 包含IF验证定位的例子)。
功能验证 (可选，但强烈推荐)
●目的: 评估POI-TurboID融合蛋白是否仍然保留POI的已知生物学功能。功能的丧失可能意味着融合干扰了POI的结构或活性，从而影响后续PPI研究的可靠性。
●方法: 根据POI的已知功能设计相应的细胞学或生化实验进行验证。例如：检测酶活、配体反应和通路变化等。
关键要点总结:稳转细胞系验证
一个经过充分验证的稳转细胞系应满足：
①正确的基因整合(CRISPR): TurboID序列精确插入目标基因座。
②预期的蛋白表达: Western Blot检测到正确大小的融合蛋白，表达水平适宜。
③正确的亚细胞定位:免疫荧光显示融合蛋白位于POI应在的细胞区域。
④保留的生物学功能(理想情况):融合蛋白仍能执行POI的已知功能。
小结
本文我学习了稳转细胞系的建立及验证，其中包括表达系统的转导、挑选单克隆以及细胞系的验证，希望对你们也有帮助。本文属于PL-MS完整实验指南的一部分，由于篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将学习邻近标记实验、亲和富集及质谱数据的筛选。另外PL-MS实验中的技术难点和常见解决办法，我也将在后续内容中整理，欢迎持续关注！
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