作者，Evil Genius
本篇是一些总结，为基因组的内容做一些准备。
单细胞空间检测CNV、和基因组WGS/WES检测CNV都是分析中常见的内容，其中单细胞空间常用的方法是inferCNV、inferCNVpy、SpatialinferCNV等，而WGS/WES常用的是cnvkit、GATK、VarScan2。
我们来汇总一下关于CNV的检测方法， 最后比较一下单细胞空间与基因组检测CNV的差异。
总结完就知道为什么现在都要求上多组学了，而且单细胞 + WES是目前最经济的多组学方案。
先来看单细胞空间的部分
1. inferCNV（经典单细胞CNV推断工具）
方法原理
inferCNV 是最早用于 scRNA-seq 数据 CNV 检测的 R 包，其核心思路是：
- 参考表达谱构建：使用正常细胞（如免疫细胞、基质细胞）的基因表达作为基线参考。
- 基因组滑动窗口平滑：按染色体位置排序基因，计算每个细胞在滑动窗口（默认100个基因）内的平均表达量。
- CNV信号提取：比较肿瘤细胞与参考细胞的表达差异，推断拷贝数变化（缺失/正常/扩增）。
- 聚类分析：使用层次聚类或Leiden算法识别具有相似CNV模式的细胞亚群。
- **HMM（隐马尔可夫模型）：预测离散的CNV状态（如单拷贝缺失、双拷贝缺失、扩增等）。
课程上我们讲解的更加详细
包括阈值的选择
关键参数
(1) 数据预处理
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| cutoff | 基因表达量阈值（过滤低表达基因） | 0.1 |
| min_cells_per_gene | 基因至少在多少细胞中表达 | 3 |
| num_ref_groups | 参考细胞分组数（提高参考稳健性） | 3 |
(2) CNV计算
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| window_length | 滑动窗口大小（基因数） | 100 |
| smooth_method | 平滑方法（"pyramidinal"或"runmeans"） | "pyramidinal" |
| max_centered_threshold | 中心化截断值（控制极端值） | 3 |
(3) 聚类方法
| 参数 | 功能 | 选项 |
|---|
| cluster_method | 聚类算法 | "hclust"（层次聚类）或 "leiden"（社区检测） |
| leiden_resolution | Leiden聚类的分辨率（值越大，亚群越多） | 1.0 |
| hclust_method | 层次聚类方法（"ward.D", "complete"等） | "ward.D" |
(4) HMM（可选）
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| HMM | 是否运行HMM预测CNV状态 | FALSE |
| HMM_type | HMM类型（"i3"=3状态，"i6"=6状态） | "i3" |
| tumor_subcluster_pval | 肿瘤亚群显著性阈值 | 0.1 |
2. inferCNVpy（Python优化版）
方法原理
inferCNVpy 是 inferCNV 的 Python 实现，优化了计算效率，并增加了 UMAP/t-SNE 可视化 功能。
- 支持 AnnData 对象，与 Scanpy 生态无缝集成。
- 提供 交互式可视化（如 Plotly 动态热图）。
- 计算更快，适合 大规模单细胞数据集。
参加过培训班的应该知道，这个方法目前已经被多篇高分文献采用。
关键参数
(1) 数据预处理
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| min_genes | 每个细胞至少检测到的基因数 | 200 |
| min_cells | 每个基因至少表达的细胞数 | 3 |
| reference | 参考细胞类型（如免疫细胞） | None（需用户指定） |
(2) CNV计算
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| window_size | 滑动窗口大小 | 100 |
| smooth_rolling | 是否使用滚动平均平滑 | True |
| max_val | 表达量截断值（防止极端值影响） | 3 |
(3) 降维与可视化
| 参数 | 功能 | 选项 |
|---|
| use_umap | 是否对CNV矩阵进行UMAP降维 | True |
| use_tsne | 是否进行t-SNE降维 | False |
| plot_interactive | 是否生成交互式热图（Plotly） | True |
SpatialInferCNV（空间转录组CNV检测）
方法原理
SpatialInferCNV 在 inferCNV 基础上 整合空间信息，适用于 Visium等空间转录组数据：
- 空间约束平滑：在基因组滑动窗口基础上，加入 空间邻域平滑（如10× Visium的spot邻近关系）。
- 肿瘤边界识别：利用CNV模式划分 肿瘤区域 vs. 正常组织。
- 空间热点检测：识别基因组变异的空间聚集模式（如局部扩增）。
关键参数
| 参数 | 功能 | 默认值 |
|---|
| spatial_weight | 空间平滑权重（0=仅基因组，1=强空间约束） | 0.5 |
| neighborhood_size | 空间邻域范围（spot数量） | 6 |
| detect_boundaries | 是否计算肿瘤边界 | True |
| hotspot_pval | 空间CNV热点的显著性阈值 | 0.01 |
4. 方法对比与总结
| 方法 | 适用数据 | 核心算法 | 关键功能 | 计算速度 |
|---|
| inferCNV | scRNA-seq | 滑动窗口 + HMM | 层次/Leiden聚类 | 中等 |
| inferCNVpy | scRNA-seq | 优化滑动窗口 | UMAP/交互式热图 | 快 |
| SpatialInferCNV | 空间转录组 | 基因组+空间平滑 | 肿瘤边界、热点检测 | 中等 |
适用场景
- inferCNV：经典方法，适合小规模scRNA-seq数据，需R环境。
- inferCNVpy：Python用户首选，适合大数据集，支持UMAP可视化。
- SpatialInferCNV：空间转录组数据，研究肿瘤微环境。
总结
- 无参考数据？ 可尝试 CopyKAT（基于全局表达模式）。
- 需要空间信息？ 选择 SpatialInferCNV。
- 大规模数据？ 推荐 inferCNVpy（计算更快）。
再来看WES/WGS的部分
1. CNVkit（基于测序深度和靶向测序优化）
方法原理
CNVkit 是一种灵活的工具，适用于 WGS 和 WES 数据，尤其擅长 靶向测序（如panel测序） 的CNV检测。其核心步骤包括：
- 靶向区域覆盖度计算：统计每个目标区域的测序深度。
- 参考样本归一化：使用对照样本（如正常组织或公共数据库）校正技术偏差（GC含量、比对效率等）。
- 分段（segmentation）：使用 CBS（Circular Binary Segmentation） 或 HMM（Hidden Markov Model） 算法划分CNV区域。
- 调用CNV：基于log2比值和统计显著性判断拷贝数变化（缺失/扩增）。
关键参数
| 参数 | 功能 | 默认值/选项 |
|---|
| --method | 分段算法 | cbs（默认）hmm、none |
| --drop-low-coverage | 过滤低覆盖区域 | False（建议WES设为True） |
| --normal | 对照样本（用于归一化） | 需用户提供 |
| --targets | 目标区域（BED文件） | 必须提供（WES/panel测序） |
| --antitargets | 非目标区域（用于WGS） | 可选 |
| --min-variant-depth | 最低支持深度 | 20 |
适用场景：
- WES/靶向测序（如肿瘤panel测序）
- 需要高灵敏度的小CNV检测
- 无匹配正常样本时，可使用公共数据库参考
2. GATK（GermlineCNVCaller & ModelSegments）
方法原理
GATK（Genome Analysis Toolkit）提供了 GermlineCNVCaller（种系CNV）和 ModelSegments（体细胞CNV）两种方法：
- GermlineCNVCaller（适用于种系CNV）：
- 基于 Poisson Latent Factor Model（PLFM） 校正批次效应和GC偏差。
- 使用 Gaussian Mixture Model（GMM） 分段。
- 输出 CNV片段和置信度评分。
ModelSegments（适用于肿瘤-正常配对样本）：
- 计算肿瘤/正常样本的 log2比值。
- 使用 HMM 预测CNV状态（如单拷贝缺失、扩增等）。
- 可结合 Allelic Fraction（等位基因频率） 提高准确性。
关键参数
| 参数 | 功能 | 默认值/选项 |
|---|
| --model | 模型选择 | POISSON（GermlineCNVCaller）、HMM（ModelSegments） |
| --number-of-samples | 样本数（用于批次校正） | 需用户指定 |
| --minimum-total-allele-count | 最低等位基因计数 | 10 |
| --call-threshold | CNV调用阈值 | 0.5（log2 ratio） |
| --kernel-variance | HMM核方差（影响灵敏度） | 0.25 |
适用场景：
- 种系CNV检测（GermlineCNVCaller）
- 肿瘤-正常配对样本（ModelSegments）
- 需要高精度CNV边界检测
3. VarScan2（基于测序深度和统计检验）
方法原理
VarScan2 最初设计用于 SNP/Indel检测，但其 copyCaller 模块可用于CNV分析：
- 计算覆盖深度：统计目标区域的测序深度。
- 归一化：校正GC偏差和比对效率。
- 统计检验：使用 Kolmogorov-Smirnov（KS）检验 判断CNV是否显著。
- CNV调用：基于 log2比值 和 p值 判断缺失/扩增。
关键参数
| 参数 | 功能 | 默认值/选项 |
|---|
| --min-coverage | 最低覆盖深度 | 20 |
| --min-mean-rd | 最低平均测序深度 | 10 |
| --p-value | KS检验显著性阈值 | 0.01 |
| --data-ratio | 肿瘤/正常深度比值阈值 | 0.8（缺失）、1.2（扩增） |
| --somatic-p-value | 体细胞CNV的p值阈值 | 0.05 |
适用场景：
- 肿瘤-正常配对样本（体细胞CNV检测）
- 快速分析（计算量较小）
- 需要统计显著性评估
方法对比与汇总
| 工具 | 核心算法 | 适用场景 | 优点 | 局限性 |
|---|
| CNVkit | CBS/HMM + 归一化 | WES/靶向测序 | 高灵敏度，支持无对照样本 | 依赖目标区域（WGS需额外参数） |
| GATK | PLFM/HMM + 等位基因频率 | 种系/体细胞CNV | 高精度，整合GATK生态 | 计算量大，依赖正常对照 |
| VarScan2 | KS检验 + log2比值 | 肿瘤-正常配对 | 计算快，统计检验严格 | 仅适用于配对样本 |
总结
- WES/靶向测序 → CNVkit（灵活，灵敏度高）
- 种系CNV → GATK GermlineCNVCaller（批次校正能力强）
- 肿瘤-正常配对 → GATK ModelSegments 或 VarScan（VarScan更轻量）
- 需要统计显著性 → VarScan2（KS检验提供p值）
最后来总结一下单细胞空间和基因组检测CNV的核心差异
数据来源与分辨率
| 维度 | 单细胞/空间转录组 | 基因组（WGS/WES） |
|---|
| 数据基础 | 基于RNA表达量（间接推测CNV） | 基于DNA测序深度/结构变异（直接检测CNV） |
| 分辨率 | 单细胞级（~10μm空间分辨率） | 群体水平（混合细胞） |
| 覆盖范围 | 仅检测表达基因（受转录活性限制） | 全基因组/外显子组覆盖 |
检测原理差异
| 方法 | 单细胞/空间转录组 | 基因组（WGS/WES） |
|---|
| 核心信号 | 基因表达异常（如高表达基因簇提示扩增） | DNA测序深度异常/断点检测 |
| 参考基准 | 依赖正常细胞表达谱（如免疫细胞） | 依赖对照样本或公共数据库（如1000 Genomes） |
| 算法重点 | 滑动窗口平滑 + 相对表达差异 | 统计模型（如HMM/CBS） + 读段分析（PE/SR） |
技术挑战与局限
| 挑战 | 单细胞/空间转录组 | 基因组（WGS/WES） |
|---|
| 假阳性来源 | 转录噪声（如基因爆发表达） | 测序偏差（如GC含量/比对效率） |
| 灵敏度限制 | 仅能检测转录活跃区域的CNV | 可检测非编码区/沉默区域CNV |
| 空间特异性 | 可解析肿瘤微环境的空间异质性（仅空间转录组） | 无法提供空间信息 |
应用场景对比
| 场景 | 单细胞/空间转录组 | 基因组（WGS/WES） |
|---|
| 肿瘤异质性 | 识别亚克隆结构 + 空间分布（如侵袭前沿） | 检测克隆性CNV驱动事件 |
| 遗传病研究 | 不适用 | 种系CNV检测（如微缺失综合征） |
| 技术互补性 | 需结合基因组数据验证功能性CNV | 提供金标准，但缺乏单细胞分辨率 |
核心结论
直接性 vs. 间接性
- WGS/WES直接检测DNA层面的CNV，结果更可靠；
- 单细胞方法通过RNA表达间接推断，受转录调控干扰。
分辨率权衡
- 单细胞/空间数据提供细胞级分辨率但覆盖有限；
- WGS/WES提供全基因组覆盖但无法区分单个细胞。
最佳实践建议
- 先导分析：用WGS/WES鉴定高置信度CNV；
- 精细解析：用单细胞/空间数据研究异质性和功能影响；
- 多组学整合：联合DNA+RNA数据提高CNV生物学解释力（如扩增基因是否真实高表达）。
生活很好，有你更好
