铜死亡+机器学习+WGCNA+分型生信思路
膀胱癌是全球最常见的泌尿系统癌症之一。据报道，膀胱癌的发病率持续上升。在全球范围内，膀胱癌发病率在所有癌症中排名第 9 位，癌症相关死亡人数排名第 13 位 。尽管手术和联合化放疗甚至免疫疗法不断进步，但临床疗效仍然不佳。为了改善膀胱癌患者的临床疗效和预后，需要为膀胱癌的早期检测和临床治疗的预后评估确定有效的生物标志物。
图1 流程图
1.泛癌症中 IGF2BP3 的转录水平
IGF2BP3在大多数人类癌症中过表达，包括ACC、BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、PRAD、SARC、SKCM、STAD、THCA、UCEC和UCS。在膀胱癌中，与正常组织相比，肿瘤中IGF2BP3的表达明显上调，肿瘤中位水平为1.007，正常组织中为0.170（p < 0.001）（图2）。然而，在PCPG、READ和TGCT中，肿瘤和正常组织的IGF2BP3表达没有明显差异。此外，IGF2BP3在LAML和THYM中的表达较低。与 TCGA-BLCA 数据集中的正常组织相比，IGF2BP3 mRNA 在膀胱肿瘤组织中的表达明显上调（图 3A-B）。接下来，作者分析了从 GEO 网络数据库中检索到的一个膀胱癌数据集（GSE3167，平台：GPL96）中 IGF2BP3 的表达情况。这一结果与 TCGA 中的数据一致，显示膀胱癌组织中的 IGF2BP3 表达水平高于非癌组织（图 3C）。然后，作者使用接收者操作特征曲线（ROC）和 ROC 曲线下面积（AUC）评估了 IGF2BP3 预测的准确性。作者发现 ROC 曲线下面积（AUC）为 0.736（图 3D）。
图2
图3 TCGA 和 GEO 数据库中 IGF2BP3 的表达
2.IGF2BP3 表达与膀胱癌临床特征的关系
从 TCGA 中提取了 414 例膀胱癌患者的基因表达谱和临床数据。以中位水平（IGF2BP3）为临界值，将患者分为高表达组（n = 207）和低表达组（n = 207）。接下来，作者探讨了 IGF2BP3 表达水平是否与其他临床病理参数显著相关。.IGF2BP3水平与性别有明显相关性（p = 0.045）。IGF2BP3的过表达与晚期T期（p = 0.003）和组织学分级（p < 0.001）呈正相关，但与年龄、N期、M期和淋巴管侵犯等其他参数无关。为了进一步评估 IGF2BP3 表达与膀胱癌临床病理特征之间的关系，作者进行了单变量逻辑回归分析。在单变量逻辑回归分析中，IGF2BP3的表达水平与性别（p = 0.035）和T期（p = 0.002）显著相关。
3.IGF2BP3 高表达可预测膀胱癌的不良预后
为了更好地了解与患者总生存期相关的潜在风险因素，作者通过 Cox 回归模型进行了单变量和多变量分析（图 4A-B）。单变量Cox分析显示，年龄（p = 0.018）、T期（p < 0.001）、N期（p < 0.001）、M期（p = 0.002）、淋巴管侵犯（p < 0.001）和IGF2BP3表达（p = 0.015）均与浆液性膀胱癌患者的总生存率相关，因此将这些因素纳入了多变量Cox分析。如图 4B 所示，结果表明淋巴管侵犯在多变量分析中仍与总生存率相关。此外，作者还研究了 IGF2BP3 mRNA 表达与膀胱癌患者总生存期之间的关系。Kaplan-Meier 生存曲线显示，生存较差的患者 IGF2BP3 mRNA 表达水平较高（HR = 1.44，95% CI：1.07-1.94，P = 0.015）（图 4C）。作者构建了一个OS提名图，将IGF2BP3和其他预后因素（包括年龄、性别、TNM分期、淋巴管侵犯和IGF2BP3表达）整合在一起（图4D）。提名图上的点越高，代表预后因素越差。校准曲线评估了提名图在 IGF2BP3 方面的表现（图 4E）。在所有队列中，提名图校准曲线显示预测结果与观察结果之间具有良好的一致性。
图4
4.IGF2BP3 相关基因富集分析
为了识别基于 IGF2BP3 表达的 DEGs，作者从 GSE3167 数据集中通过 RNA-seq 获得了 DEGs。如图 5A 所示，确定了 DEGs。前 40 个 DEGs 如图 5B 所示。作者利用评估直接（物理）关联的 STRING 数据库 11.5 版的数据分析了蛋白质-蛋白质相互作用网络（图 5C）。为了探索 IGF2BP3 相关模块的生物学意义，作者选择了前 100 个最正相关的基因进行富集分析。基因本体-生物过程（GO-BP）富集分析显示，表皮发育和皮肤发育被富集（图 6A）。基因本体-细胞组分（GO-CC）富集分析显示，质膜外侧和含胶原的细胞外基质被富集（图 6B）。基因本体-分子功能（GO-MF）富集分析显示，受体配体活性和内肽酶活性被富集（图 6C）。KEGG 分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用是最显著富集的途径（图 6D）。
图5 基于 IGF2BP3 的 DEGs
图6 膀胱癌中 IGF2BP3 相关基因的 Go 和 KEGG 富集分析
作者使用 GSEA 比较了 IGF2BP3 低表达和高表达的数据集，以确定膀胱癌期间激活的信号通路（图 7A）。包括异体移植排斥反应（图 7B）、γ 干扰素反应（图 7C）、IL6 JAK STAT3 信号转导（图 7D）、上皮-间质转化（EMT）（图 7E）和炎症反应（图 7F）在内的多种通路在 IGF2BP3 高表达表型中具有显著意义。
图7 基因组富集分析（GSEA）的富集图
5.IGF2BP3 表达与免疫细胞浸润之间的相关性
据报道，高水平的肿瘤浸润淋巴细胞与多种实体器官恶性肿瘤的良好预后相关[23, 24]。因此，作者研究了 IGF2BP3 的表达是否与膀胱癌的免疫浸润水平相关。作者通过斯皮尔曼相关性分析了 IGF2BP3 的表达水平与用 ssGSEA 定量的免疫细胞浸润水平之间的相关性（图 8A）。此外，作者发现 IGF2BP3 的表达与 NK CD56dim 细胞（R = -0.346，p < 0.001，图 8B）和 Th17 细胞（R = -0.138，p = 0.005，图 8C）的浸润水平呈负相关。此外，IGF2BP3 的表达与细胞毒性细胞、CD8 T 细胞、DC、Th1 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和 iDC 细胞的浸润水平呈正相关（图 8D-J）。
图8 IGF2BP3 基因表达与免疫浸润的关联分析
这些数据促使作者研究 IGF2BP3 表达水平与免疫浸润之间的潜在关系。作者发现，当患者被分为 IGF2BP3 高表达和低表达时，IGF2BP3 表达水平与 Th17 细胞、细胞毒性细胞、CD8 T 细胞、DC、Th1 细胞、NK CD56bright 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和 iDC 细胞之间存在很强的显著相关性（图 9A-I）。接下来，作者利用 TIMER 分析法确定了肿瘤浸润免疫细胞与膀胱癌患者生存结果的关联。结果表明，高水平的巨噬细胞和中性粒细胞浸润与膀胱癌的不良预后有关（图 10A-B）。
图9
图10 免疫细胞浸润对膀胱癌患者预后的影响
6.IGF2BP3 的高表达会增加膀胱癌中 PD-L1 的表达
作者推测 IGF2BP3 与免疫检查点分子 PD-L1 的过度表达有关，有可能导致免疫衰竭的发生。图 11A 显示了 IGF2BP3 与免疫检查点（包括 PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4 和 TIM3）之间的热图和相关性。作者发现在膀胱癌中，IGF2BP3 的表达与 PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4 和 TIM3 的表达呈明显的正相关（图 11B-F）。此外，IGF2BP3 mRNA 的升高与 PD-L1 mRNA 的升高相关（图 11G）。此外，RT-qPCR 分析表明，与对照细胞相比，过表达 IGF2BP3 后，5637 细胞中的内源性 CD274（PDL-1）、PDCD1LG2（PDL-2）、LAG3、CTLA4 和 HAVCR2 mRNA 水平升高。相反，在 T24 细胞中敲除 IGF2BP3 会显著降低 CD274（PDL-1）、PDCD1LG2（PDL-2）、LAG3、CTLA4 和 HAVCR2 mRNA 的表达。
图11 IGF2BP3 的表达与 PD-L1 的表达明显相关
7.与正常组织相比，膀胱癌组织中 IGF2BP3 的上调表达得到验证
作者对在本院接受切除术的 95 例福尔马林固定石蜡包埋原发性膀胱癌患者的 IGF2BP3 表达进行了免疫组化染色。其中 20 例为 I 期，22 例为 II 期，22 例为 III 期，31 例为 IV 期。27 例膀胱正常粘膜样本作为对照。如图 12A-E 所示，在膀胱癌组织中，IGF2BP3 阳性染色主要出现在细胞质中。与正常组织相比，膀胱癌样本中 IGF2BP3 蛋白水平明显升高。此外，作者的研究结果表明，IGF2BP3 的表达水平与膀胱癌的分期呈正相关（图 12F）。肿瘤中 IGF2BP3 表达较高的膀胱癌患者的总生存率明显低于肿瘤中 IGF2BP3 表达较低的患者（P = 0.024）。作者使用免疫组化进一步评估了 n = 95 临床队列中 CD274（PDL-1）、CD68、CD16 和 CD3 的表达。如图 3 所示，在膀胱癌组织中观察到了 CD274 (PDL-1)、CD68、CD16 和 CD3 的表达。对 CD274 (PDL-1)、CD68、CD16 和 CD3 的平均光密度（AOD）进行定量，发现高表达 IGF2BP3 患者的 CD274 (PDL-1)、CD68、CD16 和 CD3 的平均光密度高于低表达 IGF2BP3 患者。
图12
8.IGF2BP3 促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭
为了进一步探讨 IGF2BP3 在膀胱癌细胞转移中的作用，研究人员进行了经孔迁移和侵袭试验。通过 qRT-PCR 验证了 IGF2BP3 在正常人膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）和膀胱癌细胞系（5637、J82、UMUC3 和 T24）中的表达。与 SV-HUC-1 细胞相比，膀胱癌细胞株的 IGF2BP3 水平相对较高（图 13A）。接下来，作者利用 siRNA 和慢病毒转染试验分别下调和上调了 IGF2BP3 的表达。与对照组相比，T24 和 5637 细胞中 IGF2BP3 mRNA 表达水平分别明显下调和上调（图 13B）。如图 13C 和 D 所示，沉默 IGF2BP3 表达可减少膀胱癌细胞的迁移和侵袭数量，而异位表达 IGF2BP3 则可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭率。因此，这些数据表明，IGF2BP3 促进了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。
图13
总结
作者的研究存在一些局限性。首先，IGF2BP3 是直接还是间接调控 EMT 和免疫反应仍有待确定。其次，体外迁移和侵袭实验的结果仍需在动物模型中得到验证。第三，本研究为进一步研究 IGF2BP3 与肿瘤相关免疫微环境之间的相关性奠定了基础。然而，还需要更多的研究来进一步验证这一假设。