YTHDC1介导MAFF核输出减轻肝细胞缺血再灌注氧化应激损伤

缺血再灌注（I/R）损伤是常见的病理生理过程，其核心机制是缺氧阶段线粒体呼吸链抑制、再灌注阶段爆发式活性氧（ROS）生成，继而触发炎症级联反应并造成肝细胞与非实质细胞广泛损伤。由于肝脏对氧供高度敏感，如何在分子层面调控ROS清除与炎症抑制，一直是该领域基础研究的重点。

新近发表于Cellular Signalling的一项研究，以m6A表观转录组学视角切入，系统阐释了核内m6A阅读蛋白YTHDC1—转录因子MAFF—自噬相关膜蛋白VMP1这一轴线的保护功能，为理解I/R损伤提供了新的调控框架。

研究首先在公共数据库GSE14951中发现，人原位肝移植术后复流肝组织中MAFF表达显著上调（log2FC ≈ 5.7），提示其可能在I/R应激中发挥关键作用。作者继而采用C57BL/6J雄性小鼠建立部分肝缺血60 min再灌注6 h的模型，血清ALT、AST水平骤升，HE染色示坏死面积扩大，TUNEL阳性细胞增多，GSH/GSSG比值下降、SOD活性降低、MDA累积，均符合典型氧化应激损伤表型。免疫组化进一步证实MAFF蛋白在I/R肝组织中的表达显著升高。为明确MAFF的功能，团队通过尾静脉递送携带shRNA的腺病毒实现肝内MAFF敲减（KD-MAFF），发现ALT、AST进一步升高，坏死面积及Suzuki评分加剧，凋亡比例增加，GSH/GSSG与SOD继续下降，MDA进一步堆积，提示MAFF缺失放大了氧化损伤。

在体外层面，研究者分离小鼠原代肝细胞，利用携带全长MAFF的慢病毒实现过表达（OE-MAFF），并构建6 h缺氧/2 h复氧（H6R2）模型。CCK-8结果显示，OE-MAFF显著改善细胞存活率；TUNEL染色证实凋亡率下降；DHE探针显示ROS生成减少；Western blot显示p-NRF2水平升高，提示抗氧化通路被激活。为进一步明确MAFF的下游靶点，作者整合hTFtarget预测与GSE14951差异基因交集，锁定VMP1、BIRC3、FAM65A、CELF2四个候选基因。其中VMP1与MAFF表达呈最强正相关（r = 0.8），且启动子区存在显著MAFF结合峰（UCSC ChIP-seq数据）。ChIP-qPCR及双荧光素酶报告实验均证实MAFF可直接结合VMP1启动子并增强其转录活性。

功能实验显示，在MAFF敲减小鼠中回补VMP1（OE-VMP1）可显著逆转ALT、AST升高，减少坏死面积及凋亡，恢复GSH/GSSG、SOD水平并降低MDA，同时提升p-NRF2。相反，在原代肝细胞中，即便MAFF过表达，若通过shRNA干扰VMP1（KD-VMP1），则细胞存活率下降、凋亡增加、ROS上升、p-NRF2下降，证实VMP1是MAFF发挥保护功能的必要下游。炎症因子ELISA及p-NF-κB p65磷酸化水平检测亦表明，MAFF-VMP1轴可同时抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的上调及NF-κB通路激活。

随后，作者将视野上移至MAFF自身的表达调控。通过RNA互作数据库与GSE14951差异基因交叉，发现ZFP36、HNRNPA1及YTHDC1三个RNA结合蛋白皆与MAFF mRNA潜在结合，而SRAMP预测显示MAFF mRNA存在高置信度m6A修饰位点。YTHDC1作为核内m6A阅读器，在I/R肝组织及H/R肝细胞中表达均显著上调。利用慢病毒介导的shRNA敲减YTHDC1后，MAFF mRNA稳定性下降，胞质定位减少，蛋白水平降低；RNA免疫沉淀（RIP）证实YTHDC1可富集MAFF转录本；Actinomycin D半衰期实验进一步表明YTHDC1缺失缩短MAFF mRNA寿命。由此可知，YTHDC1通过m6A依赖的方式促进MAFF核输出并维持其稳定表达。

动物层面验证显示，尾静脉给予腺病毒实现YTHDC1过表达（OE-YTHDC1）可显著降低I/R小鼠血清ALT、AST，减少坏死与凋亡，恢复氧化还原平衡并提升p-NRF2；若同时敲减MAFF，则上述保护效应被完全抵消。细胞实验亦证实，敲减YTHDC1加重H/R损伤，而OE-MAFF可逆转YTHDC1缺失导致的细胞存活率下降、凋亡及ROS增加，说明YTHDC1的保护作用依赖于MAFF。炎症因子检测同样提示，YTHDC1过表达可降低TNF-α、IL-1β、IL-6及p-NF-κB p65，而MAFF敲减则阻断此效应。

原代肝细胞分离采用37 °C预温的IV型胶原酶灌注，Percoll密度梯度纯化后贴壁4 h，换无血清William’s E培养基继续培养24 h，再用1% O₂/5% CO₂/94% N₂缺氧6 h，21% O₂复氧指定时间。慢病毒感染后7 d嘌呤霉素筛选获得稳转株。

试剂方面，AbMole的葡萄糖氧化酶（M31283）被用于IHC显色增强体系，与β-D-葡萄糖、DAB及氯化铵共同构成高灵敏度显色底物，确保了低丰度蛋白的可视化。Glucose oxidase（GOD，葡萄糖氧化酶）是一种氧化还原酶，能通过与细胞内的氧气 (O2)和β-D-葡萄糖反应，生成过氧化氢 (H2O2) 和葡萄糖酸，从而切断癌细胞的营养来源，抑制癌细胞的增殖。所有实验数据均以mean ± SEM呈现，采用GraphPad Prism 8.0.2进行统计学分析，两组间比较使用非配对t检验，多组间采用单因素或双因素ANOVA并辅以Tukey多重比较，显著性阈值设为p < 0.05。

Glucose oxidase | 9001-37-0 | AbMole | GOD; EC 1.1.2.3.4; beta-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase

综上，该研究首次将m6A表观转录调控与I/R损伤中氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及自噬联系起来，阐明YTHDC1通过识别MAFF mRNA的m6A修饰并促进其核输出，进而增强MAFF蛋白表达；MAFF作为转录因子直接激活VMP1启动子，VMP1再通过抑制ROS产生、恢复NRF2磷酸化、阻断NF-κB通路，最终减轻肝细胞损伤。YTHDC1/MAFF/VMP1这一完整轴线的发现，不仅加深了对I/R损伤分子网络的理解，也为后续开发基于表观转录调控的干预策略提供了新的靶标与实验依据。