【酶解法】小鼠脾脏单细胞悬液的制备指南
目录
引言
1. 消耗品和试剂
2. 实验程序
3. 常见问题与解决策略
4. 解离效果
5. 其他产品推荐
引言
小鼠脾脏是一个重要的免疫器官，位于小鼠的左腹腔，靠近胃的左侧，呈长条状。脾脏的大小会根据小鼠的品种和健康状况有所不同，但通常情况下，成年小鼠的脾脏长度大约在1.5 cm到2.5 cm之间。脾脏的颜色和质地可能因品种和健康状况而异，通常呈叶状，颜色为深红色。在实验研究中，小鼠脾脏细胞的分离、培养和计数是免疫学研究的一个重要方法，也是流式细胞术分析的前提。
不仅如此，在免疫学研究中，脾脏作为小鼠的重要免疫器官也扮演着至关重要的角色。它是机体应对外界病原体入侵的前线防线，具有滤过血液、生成免疫细胞、清除衰老红细胞等多重功能。因此，脾脏细胞的分离与研究成为了免疫学领域中不可或缺的技术之一。通过对小鼠脾脏单细胞悬液的制备，研究人员能够深入了解脾脏细胞的功能，尤其是免疫细胞的种类、状态及其相互作用。本文将详细探讨如何通过酶解法制备小鼠脾脏单细胞悬液，特别是流式细胞术分析中常用的方法与技术难点以供读者了解相关方法并供有需人士参考研究。
1. 消耗品和试剂
表1：小鼠脾脏组织解离试剂参考表
| 材料 | 试剂/设备 |
|---|---|
| 15/50 mL 离心管 | 1x PBS 缓冲液 |
| 10 cm 培养皿 | RPMI 1640 培养基 |
| 眼科外科剪刀 | 电子移液器，1mL 移液头 |
| 75% 酒精 | 高速离心机 |
| 100 μm 细胞筛 | 流式细胞术试管 |
| FBS | 吸涡仪 |
| HBSS 平衡液 | 4°C 冷冻箱 |
| Absin 组织解离试剂盒 | 细胞染色缓冲液 |
表2：产品信息
| 产品目录编号 | 产品名称 | 规格 | 用途 |
|---|---|---|---|
| abs50097 | 小鼠脾脏组织解离试剂盒 | 10T/25T | 组织解离 |
| abs7303 | 5 mL 流式细胞术试管（无酶、带盖） | 500个/箱 | 流式细胞术试管 |
| abs9484 | RPMI1640 培养基 | 500mL | 维持细胞活性 |
| abs7232 | 70μm 细胞筛 | 100个/箱 | 试剂耗材 |
| abs7102 | 15 mL 离心管（圆底） | 100个/袋 | 试剂耗材 |
| abs7100 | 50 mL 离心管（圆底） | 40个/袋 | 试剂耗材 |
| abs962 | PBS 缓冲液（1x） | 500mL | 试剂 |
| abs9475 | 细胞染色缓冲液 | 500mL | 试剂 |
| abs9101 | 红细胞裂解液（1x） | 100mL/500mL | 裂解红细胞 |
2. 实验程序
实验前准备：
将小鼠脾脏组织解离试剂盒预热至37°C水浴中（收到脾脏组织解离试剂后，建议分装并冷冻保存）。如果红细胞裂解液是10×浓缩的，需要提前用超纯水稀释至1×。PBS需要提前预冷。
-
将小鼠脖部脱位处死，使用75%酒精消毒小鼠表面，取小鼠左腹部朝上，用镊子辅助操作，提起左腹部中间的皮肤，切开皮肤后，可以看到肉眼可见的深红色、条状的脾脏，切开腹膜，使用镊子将脾脏提起，看到脾脏与周围组织分离后，尽量去除连接组织和脂肪，使用PBS清洗脾脏，取约100mg-200mg的新鲜小鼠脾脏组织（20g的小鼠，脾脏大约100mg，具体情况根据实际操作为准），加入到50mL无菌离心管中，用眼科剪刀将组织切成1-2mm的小块。
-
向离心管中加入1mL的小鼠脾脏组织解离试剂，将离心管放在恒温摇床上，在37°C、180rpm下孵育约30分钟，消化脾脏组织，根据组织状态适当调整消化时间（脾脏相对较易消化）。
红圈内：死细胞 绿圈内：活细胞
- 孵育结束后，将离心管中的组织匀浆液用70μm无菌滤网过滤，然后加入细胞培养基冲洗滤网，收集滤液至50mL离心管中。
- 将收集到的滤液以1200rpm离心5分钟，弃去上清液。
- 在组织解离过程中，可以使用红细胞裂解液去除红细胞，具体操作是：向步骤4中得到的沉淀加入3mL的1×红细胞裂解液，重悬沉淀，涡旋混匀，室温暗处孵育3-5分钟，加入2mL预冷的PBS，1200rpm离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤一次。
- 弃去上清液后，用细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10⁶ 细胞/mL，分装100μL/管至12×75mm的流式细胞术试管中，进行后续实验。
3. 常见问题与解决策略
-
细胞产量低
通常情况下，成年C57BL/6小鼠的脾脏可解离出约10×10⁸细胞。如果细胞产量特别低，需要注意在样本采集阶段尽量去除组织周围的脂肪，并尽可能切细组织以提高细胞产量。在洗涤步骤中，使用移液管吸取脂肪上层液体，避免在吸取时堵塞移液头。 -
细胞活性低，死细胞/碎片多
首先，解离试剂的孵育时间不宜过长，长时间孵育会导致细胞活性降低和表面标志物丧失，出现大量死细胞和DNA纤维释放，导致溶液粘稠。其次，不要缩短清洗步骤，清洗有助于去除细胞附着物、碎片和死细胞。红细胞裂解液的孵育时间不能过长，一般为5分钟。如果细胞活性仍然很低，建议检查红细胞裂解液是否新鲜有效。 -
红细胞裂解不完全
表现为洗涤步骤后出现明显的红色沉淀。确保使用新鲜的红细胞裂解液，在室温下裂解。在裂解前确保细胞完全重悬，并且裂解时间不宜过短。
4. 解离效果
使用该试剂盒后，已将小鼠脾脏组织处理成单细胞悬液，并进行流式细胞术分析：细胞活性、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果如图所示。
注意：此产品仅用于科研实验，不支持临床研究。
5. 其他产品推荐
| Catalog number | Product name | specification |
| abs9907 | Flow cytometry absolute counting tubes | 50T |
| abs9477 | Mouse Fc receptor blocker | 200T/500T |
| abs9476 | Human Fc receptor blocker | 50T/200T |
| abs9488 | Sheath fluid | 20L |
| abs9107 | Phoboester | 1mg/5mg/25mg |
| abs9108 | Ionomycin calcium salt | 1mg/5mg |
| abs970 | D-PBS buffer (1 ×, no calcium magnesium) | 500mL |
| abs810012 | Brefeldin A | 10mg/25mg/50mg |
| abs812975 | Monensin sodium salt | 25mg/100mg |
| abs9475 | Cell staining buffer | 500mL |
| abs9110 | fixer | 50mL |
| abs9111 | Permeabilization agent | 150mL |
| abs7303 | 5 mL flow cytometry tubes (sterile, enzyme-free, with caps) | 1 box |
| abs1840002 | APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9) | 25T/100T |
| abs182427 | PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4) | 25T/100T |
| abs182430 | FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4) | 25T/100T |
| abs180046 | PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96) | 25T/100T |
| abs1840696 | FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4) | 25T/100T |
| abs182338 | APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5) | 25T/100T |
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